-
Kính hiển vi đồng tiêu đề cập đến một loại kính hiển vi quang học đặc biệt có thể ghi lại các lát quang học.
Bằng cách chiếu sáng và quan sát một điểm giới hạn nhiễu xạ duy nhất, việc cắt quang học được thực hiện trong một hệ thống đồng tiêu laser. Điều này đòi hỏi hai phân đoạn chùm tia có cùng trọng tâm, vì vậy chúng là "đồng tiêu". Trái ngược với hình ảnh trường rộng, hình ảnh đồng tiêu không có sự mờ nhạt. Đây là một lợi thế trong chính nó, bởi vì hình ảnh sâu của mẫu rất rõ ràng và phong phú về chi tiết. Tuy nhiên, lợi thế quan trọng nhất là tiềm năng trực quan ba chiều của nó với các tính năng hiển vi. Sau khi chuỗi hình ảnh được thu thập dọc theo Z-stack, đối tượng 3D được máy tính tái tạo và hiển thị.
- Ánh sáng đồng tiêu
Ánh sáng nguồn ánh sáng điểm được thực hiện bằng cách tập trung nguồn ánh sáng vào khẩu độ nhỏ (lỗ kim) và sau đó tập trung vào mẫu. Khi khẩu độ đủ nhỏ, điểm chiếu sáng chỉ bị giới hạn bởi nhiễu xạ, không phải bởi các tham số hình học của nguồn sáng và khẩu độ. Nguồn ánh sáng thông thường là một nguồn ánh sáng bề mặt lớn, do đó không thể tập trung vào điểm giới hạn nhiễu xạ. Do đó, mặc dù độ truyền qua rất thấp, loại ánh sáng chiếu sáng tập trung này vẫn rất cần thiết (đối với các nguồn sáng truyền thống).
Hình 1: chiếu sáng cho hình ảnh đồng tiêu. Ánh sáng từ nguồn ánh sáng (LS) tập trung vào lỗ kim chiếu sáng (PI) và sau đó vào mẫu S ..
Laser như một nguồn ánh sáng có sự kết hợp rất cao (ánh sáng trong laser tốt là "cực kỳ song song"). Do đó, laser có thể được tập trung vào một điểm bị giới hạn nhiễu xạ thông qua một ống kính mà không sử dụng lỗ kim. Do đó, hầu hết các kính hiển vi đồng tiêu không có lỗ kim chiếu sáng. Chất lượng của điểm ánh sáng phụ thuộc vào chất lượng chùm tia của laser. Nếu chất lượng không tốt, bạn cũng có thể chèn lỗ kim chiếu sáng. Laser thường được ghép với kính hiển vi đồng tiêu thông qua sợi quang. Những sợi này cũng hoạt động như lỗ kim.
Sự tiêu cự và mật độ năng lượng cao của laser làm cho nó trở thành một nguồn ánh sáng lý tưởng cho kính hiển vi đồng tiêu. Sự kết hợp của laser không phải là một tính năng cần thiết của hiệu suất đồng tiêu. Ngược lại, đó là một thách thức đối với các nhà thiết kế quang học, bởi vì nó sẽ gây ra các mẫu can thiệp sai, vì vậy các chiến lược thiết kế cẩn thận là cần thiết.
Ngoài ra, thực tế là laser truyền thống chỉ phát ra một màu duy nhất (laser- "dòng") có những hạn chế riêng. Trong hình ảnh và đo lường đa fluor phát quang, cần có sự sắp xếp đa laser phức tạp. Laser trắng khéo léo giải quyết vấn đề hình ảnh nhiều màu.
Hình 2: So sánh hình ảnh đồng tiêu (bên phải) và hình ảnh không liên quan. Trong Feulgen nhuộm chuột Trophoblast. Rất nhiều thông tin về hình ảnh không liên quan không đến từ mặt phẳng tiêu cự. Quang học đồng tiêu loại bỏ tất cả các yếu tố mờ và làm cho cấu trúc rõ ràng.
Phát hiện đồng ý
Hầu hết các máy dò có một khu vực nhạy cảm khá lớn (các ống photomultiplier thường là vài cm vuông). Quang học đồng tiêu cần cảm biến điểm. Do đó, cần phải thực hiện phát hiện tại chỗ bằng cách chèn khẩu độ nhỏ (lỗ kim) vào chùm sáng. Tập trung ánh sáng của mẫu vào lỗ kim, thu thập và ghi lại ánh sáng truyền.
Bởi vì mẫu nhiễu xạ phụ thuộc vào khẩu độ số và bước sóng, nên việc phát hiện pinhole là cần thiết. Do đó, khi các tham số này thay đổi, kích thước lỗ kim phải được điều chỉnh.
Khi ống kính khách quan thay đổi (thường là thay đổi khẩu độ số), kính hiển vi quét đồng tiêu hiện đại sẽ tự động thay đổi đường kính lỗ kim một cách thích hợp. Do đó, lỗ kim thường được thiết kế dưới dạng khẩu độ đôi hoặc nhiều lớp.
Trên thực tế, kích thước thích hợp của lỗ kim không chỉ phụ thuộc vào bước sóng và khẩu độ số, mà còn vào độ phóng đại bên trong của các phần tử quang trong kính hiển vi.
Do đó, không chỉ không mong muốn mà còn sai khi so sánh trực tiếp đường kính pinhole trong kính hiển vi với các thiết kế khác nhau. Nếu đường kính pinhole không được đặt thành giá trị tối ưu, hệ thống sẽ không thể thực hiện cắt quang trơn tru (nghĩa là truyền khử độ mờ) hoặc cắt đứt cường độ không cần thiết mà không có được chất lượng cắt quang học thêm (dẫn đến hình ảnh nhiễu không cần thiết).
Hình 3: Phát hiện trong hình ảnh đồng tiêu. Ánh sáng từ mẫu S được tập trung vào lỗ kim quan sát (PO) và sau đó trên máy dò de.
Đường dẫn quang học của quét đồng tiêu
Đường dẫn chùm tia đồng tiêu trong hệ thống quét đồng tiêu chỉ là sự kết hợp của chiếu sáng nguồn điểm và phát hiện điểm. Sự kết hợp này có thể được sử dụng như một con dao quang học. Chỉ các photon từ mặt phẳng tiêu cự mới có thể được truyền đến cảm biến. Trong khi tất cả các photon từ những nơi khác được lọc ra. Cắt quang học được thực hiện bằng "bộ lọc không gian".
Vì chỉ có một điểm xuất hiện hình ảnh "đồng tiêu" trong một thời gian nhất định, nên cần thiết bị quét để di chuyển vị trí trên trường đối tượng ở chế độ lưới. Thông thường, gương quang được cài đặt trên động cơ quét và được sử dụng để thực hiện quy trình quét. Có một nút cổ chai trong thời gian cần thiết để quét một khung hình đầy đủ (thường là) 1.024 dòng. Các cải tiến đã đạt được bằng cách giới thiệu một máy quét tốc độ cao (máy quét cộng hưởng) quét 8, 000 hoặc nhiều dòng hơn mỗi giây.
Chỉ dưới công nghệ kính hiển vi của ánh sáng phản xạ mới có thể đạt được một lát quang tốt. Đây là một trong những lý do cho sự phát triển mạnh mẽ của kính hiển vi huỳnh quang trong 20 năm gần đây (các lý do khác bao gồm phát minh ra miễn dịch, lai DNA, sinh học huỳnh quang, chấm lượng tử và protein huỳnh quang).
Hình 4: Từ trái sang phải: 1. Hình nón chiếu sáng không chỉ kích thích thuốc nhuộm huỳnh quang trong mặt phẳng tiêu cự, mà còn kích thích nó lên xuống. Ở đây đại diện bởi một hình nón đôi màu xanh lá cây. 2. Hỗ liềm phát xạ đánh chặn hiệu quả ánh sáng phát ra từ phía trên mặt phẳng tiêu cự. 3. 4. Trong hệ thống đồng tiêu, chỉ có ánh sáng từ mẫu sẽ đến máy dò. Phát hiện Pinholes sẽ từ chối hiệu quả bất kỳ ánh sáng nào từ các khu vực khác. Cuối cùng, phần quang học thực sự thu được.
